(Noticias de Nanowerk) Medir el número y las propiedades de las células que se mueven en una corriente, un proceso llamado citometría de flujo, es de vital importancia en la medicina diagnóstica, la investigación farmacéutica y la ciencia biomédica. Ahora, los investigadores del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) han encontrado una manera de realizar mejoras sin precedentes en la tecnología.
En la citometría de flujo, las células generalmente se etiquetan con material fluorescente, se irradian con luz láser cuando cruzan un punto específico en un canal de líquido del tamaño de un cabello humano (lo suficientemente estrecho como para que las células generalmente se muevan en una sola fila) y que desde el la luz que emitieron registró los marcadores en la celda. El análisis de las emisiones revela varias características, como el tipo de célula, el tamaño, el contenido de ADN y la etapa del ciclo de división celular.
Pero el método de medición simple convencional carece de un medio para cuantificar las fluctuaciones en sus lecturas. Por ejemplo, un citómetro que mide biomarcadores de cáncer puede usar una lectura específica para distinguir entre células sanas y enfermas. Una celda puede devolver un valor ligeramente más bajo e identificarlo como saludable. Pero se desconoce el rango de valores que el instrumento podría devolver para mediciones repetidas de esta celda.
Esto es problemático porque no se sabe con qué frecuencia el valor podría falsear el diagnóstico. Por ejemplo, una alta confianza es esencial al contar las células tumorales circulantes que conducen a la metástasis del cáncer; En una muestra de sangre, puede haber solo una célula tumoral entre un millón de otras. Mejorar la capacidad de resolver estos eventos raros podría conducir a una detección más temprana y mejores opciones de tratamiento.
Del mismo modo, los recuentos imprecisos de diferentes poblaciones celulares, como B. células inmunitarias, en una muestra dan lugar a un diagnóstico incorrecto de una enfermedad oa una mala interpretación del éxito de un tratamiento farmacológico. Puede ser difícil decir si las diferentes medidas resultan de diferentes tipos de células o simplemente de la variabilidad experimental.
Para abordar esta situación, los investigadores del NIST desarrollaron y validaron un sistema novedoso que registra directamente la magnitud de la variación en las mediciones de citometría de flujo para cuantificar la incertidumbre. Su instrumento realiza una serie de mediciones múltiples de la misma partícula, cuya posición y velocidad se controlan con precisión a medida que se mueve en el canal, lo que le permite observar errores dependientes de la medición de tan solo el 1 %.
«Esta es la primera vez que podemos medir la incertidumbre por objeto directamente en un citómetro de flujo», dijo Matthew DiSalvo, autor principal del equipo del NIST que publicó sus hallazgos en la revista. Laboratorio en un chip («Citometría de flujo en serie en un microchip optofluídico con enfoque inercial para la evaluación directa de errores de medición»). «Si mide algo una vez y solo una vez, no puede verificar la precisión», dijo. “Necesitas repetibilidad para hacer eso”.
El nuevo citómetro de flujo en serie a escala de chip aborda este problema tomando cuatro mediciones de cada partícula: dos mediciones en cada uno de los dos puntos diferentes con una separación de 16 milímetros; (aprox. 0,6 pulgadas) en el canal con velocidades de flujo de hasta 100 o más partículas por segundo.
Se tuvieron que superar varios desafíos críticos para desarrollar el nuevo citómetro, que inicialmente se probó usando perlas de plástico uniformes de unas 15 micras (µm, millonésimas de metro) de diámetro, aproximadamente una décima parte del ancho de un cabello humano y del mismo tamaño que los glóbulos blancos promedio.
Un desafío fue fabricar un canal (aprox. 40 µm por 80 µm) que contenía dos zonas idénticas donde la luz láser se dirigía a la partícula que pasaba y asegurar que la mayor parte de la luz fluorescente emitida fuera capturada por un par de detectores, que se midieron tanto Río arriba y río abajo. Con este fin, DiSalvo y el líder del proyecto, Gregory Cooksey, desarrollaron guías de ondas avanzadas que minimizaban las pérdidas y evitaban que la luz emitida se propagara. Cooksey tiene una amplia experiencia con diseños innovadores para microfluidos y el equipo de citómetros se basó en este trabajo.
Otro desafío particularmente desafiante fue encontrar una manera de garantizar que las emisiones registradas en cada una de las dos zonas del canal provengan de la misma partícula. Esto solo fue posible controlando la posición y la velocidad de la partícula con tanta precisión que el tiempo de tránsito de un nodo al otro se conoció con precisión, lo que permitió que el sistema igualara las mediciones en el primer nodo con las del segundo.
Para ello, los investigadores desarrollaron una técnica «híbrida» para enfocar la partícula en un punto específico del canal. En los citómetros convencionales, esto generalmente se logra mediante el uso de dos bombas de líquido distintas: una para inyectar las partículas y otra para crear una cubierta de líquido separada alrededor de la circunferencia interna del canal, formando efectivamente un tubo de líquido dentro del canal sólido. Esto atrapará la muestra en el núcleo central del canal.
O al menos esa es la suposición. Pero en realidad, según Cooksey, los canales pequeños son «el peor lugar posible para ponerlo».
Esto se debe a que la inercia del líquido en pequeños canales ejerce dos fuerzas sobre la partícula. Una fuerza actúa para levantar la partícula lejos de la pared. Pero otra fuerza empuja a la partícula lejos del centro del canal debido a la diferente velocidad del fluido que actúa a cada lado de la partícula. Como resultado, la partícula tiende naturalmente a moverse fuera del centro a una posición de equilibrio donde las fuerzas están balanceadas. Con el diseño específico utilizado en este estudio, el desplazamiento desde la línea central varía con la velocidad del fluido desde aproximadamente 11 µm a 0,75 metros por segundo hasta 14 µm a 1,35 m/s.
Para controlar esta posición con mucha precisión, DiSalvo y Cooksey utilizaron cuatro bombas para impulsar la envolvente, lo que les permitió ajustar la presión de lado a lado y de arriba a abajo. «Usamos la hidrodinámica para poner la partícula al comienzo de su tránsito donde sabemos que quiere ir», dijo DiSalvo. «Entonces, cuando una partícula se acelera a través del canal, ya está en su posición de equilibrio. Esto se mantiene con mucha precisión en toda la longitud del citómetro”.
Esto permite que el dispositivo realice mediciones de alta precisión en partículas en movimiento con una alta velocidad de 1 m/s. (1 m/s, o alrededor de 2,3 mph, puede parecer lento. Pero a esa velocidad, una partícula de 10 µm se mueve 100 000 veces la longitud de su cuerpo por segundo. Un automóvil que haga eso iría a aproximadamente 1 millón de mph).
Desde que se informaron los experimentos en el nuevo artículo de la revista, el equipo ha estado midiendo los glóbulos blancos en el dispositivo. «Primero, observamos dónde se encuentra la célula en su ciclo de división», dijo Cooksey. “Observamos cuánto ADN hay en la célula. La señal de fluorescencia nos permite cuantificar cuántas de las células se están dividiendo activamente y realizando la síntesis de ADN”.
Los investigadores también usan diferentes longitudes de onda de láser para revelar diferentes propiedades de la muestra.
«Modificamos ampliamente las guías de ondas para aumentar la sensibilidad mediante la incorporación de microlentes y otras mejoras», dijo DiSalvo. «Creemos que pronto podremos proporcionar mediciones de incertidumbre mientras logramos la sensibilidad de los sistemas de medición independientes comerciales que cuestan cientos de miles de dólares».
El proyecto Cytometer involucra a colaboradores con experiencia en matemáticas y modelado, lo que lleva a nuevos métodos de análisis adicionales que mejorarán la cuantificación y la clasificación. Los investigadores del NIST, Paul Patrone y Anthony Kearsley, utilizaron el análisis de señales para filtrar el sesgo debido a las variaciones de flujo y el tamaño de las partículas. Sus métodos también permiten una capacidad sin precedentes para identificar y separar objetos que anteriormente estaban demasiado juntos para distinguirlos mediante una medición convencional. La incapacidad para distinguir objetos separados impide la precisión del conteo y podría resultar en la pérdida de componentes de muestra distintos, como B. células tumorales circulantes o células inmunitarias que interactúan.
