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(noticias nanowerk) Investigadores de la Universidad de Kanazawa informan en Registros de estrellas (“Protocolo para imágenes en vivo de estructuras intracelulares a nanoescala utilizando microscopía de fuerza atómica con sondas de nanoagujas”) Detalles del procedimiento y consejos para nanoendoscopia-AFM para capturar imágenes de estructuras a nanoescala en células vivas.
Cada vez hay más demanda de imágenes de estructuras a nanoescala dentro de células vivas para proporcionar información sobre la estructura y función de las células. Hasta ahora, las herramientas para capturar tales imágenes han sido limitadas en muchos sentidos, pero investigadores dirigidos por Takeshi Fukuma y Takehiko Ichikawa de la Universidad de Kanazawa han desarrollado un protocolo completo para usar microscopía de fuerza atómica (AFM) para obtener imágenes del interior de células vivas y publicaron .
Desarrollado por primera vez en la década de 1980, el AFM utiliza los cambios de fuerzas entre la superficie de una muestra y una punta a nanoescala unida a un voladizo para «sentir» superficies y generar imágenes de topografía con resolución a nanoescala. La técnica se ha vuelto cada vez más sofisticada para extraer información sobre muestras a velocidades suficientes para que la herramienta capture imágenes en movimiento de dinámica a nanoescala.
Sin embargo, hasta ahora se ha limitado a superficies. Existen otras técnicas que permiten mirar el interior de una celda, pero con limitaciones. Por ejemplo, existe la microscopía electrónica, que es capaz de resolver detalles a nanoescala y menores, pero las condiciones de funcionamiento requeridas son incompatibles con las células vivas.
Alternativamente, la microscopía de fluorescencia se utiliza habitualmente en células vivas. Si bien existen técnicas de fluorescencia para aumentar la resolución, existen desafíos prácticos que obstaculizan la obtención de imágenes de fluorescencia a nanoescala.
Con AFM, no existe ninguna de estas limitaciones. Al equipar la herramienta con una nanoaguja para penetrar las células, Fukuma, Ichikawa y sus colaboradores demostraron recientemente la capacidad de obtener imágenes del interior de las células a nanoescala, en lo que llaman nanoendoscopia AFM.
En su protocolo, los investigadores dividen el método de nanoendoscopia AFM en cuatro etapas. Los primeros pasos incluyen la preparación celular y la tinción con un tinte fluorescente, así como la comprobación de la fluorescencia, que se utiliza para identificar rápidamente el área de la imagen. Luego viene la fabricación de las propias nanoagujas, para lo cual hay dos opciones: grabar una estructura de nanoagujas con un haz de iones enfocado o construir una mediante deposición de haz de electrones. Luego viene la fase de nanoendoscopia en sí, y en el informe los investigadores describen el enfoque para la nanoendoscopia tanto 2D como 3D.
Incluso se brindan detalles para describir cuál es la mejor manera de limpiar después de tomar las imágenes de nanoendoscopia, antes de explicar finalmente el procesamiento de datos necesario para visualizar los datos de medición. El método incluye numerosos consejos para completar con éxito cada etapa, así como una guía de solución de problemas si algo no funciona del todo.
Esta técnica debería ser adecuada para observar estructuras intracelulares intactas, incluidas mitocondrias, adherencias focales, retículo endoplasmático, lisosomas, aparato de Golgi, uniones de orgánulos y estructuras separadas en fases líquido-líquido. Concluyen: «Se puede esperar que este protocolo se convierta en una herramienta estándar para estudiar estructuras a nanoescala».
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