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(noticias nanowerk) Una visión a nanoescala de las células vivas puede proporcionar información valiosa sobre la estructura y función de las células. A lo largo de los años se han utilizado varias técnicas de microscopía para obtener información sobre muestras biológicas a nanoescala, pero todas han tenido sus limitaciones y desafíos. Aunque la microscopía de conductividad iónica de barrido (SICM) ha demostrado la capacidad de obtener imágenes de muestras biológicas vivas en solución con resolución a nanoescala, se ha visto obstaculizada por desafíos en la fabricación confiable de nanopipetas con la geometría óptima para la tarea.
Ahora, investigadores dirigidos por Yasufumi Takahashi en Nano LSI de la Universidad de Kanazawa y la Universidad de Nagoya han desarrollado un protocolo para fabricar nanopipetas de forma reproducible con la geometría preferida para obtener imágenes de alta calidad. En la microscopía de conductividad iónica de barrido (SICM), se utiliza una nanopipeta para controlar la distancia entre la nanopipeta y las muestras utilizando una corriente iónica como señal de retroalimentación.
El equipo informa sus hallazgos en Química analítica (“Directrices para la fabricación de nanopipetas para imágenes SICM a nanoescala”).
La forma de la nanopipeta afecta significativamente el rendimiento del dispositivo. Por ejemplo, una apertura grande limita la posible resolución, una derivación larga puede provocar efectos de rectificación que distorsionan las mediciones de la corriente iónica y, si el vidrio de la nanopipeta es demasiado grueso, puede deformar la muestra antes de que se acerque al punto de apertura requerido para una ion constante. Se requiere mapeo topográfico actual. Por lo tanto, la nanopipeta ideal tiene una derivación corta, un orificio pequeño y paredes de vidrio delgadas.
El procedimiento estándar para fabricar la nanopipeta es extraer un tubo capilar con un extractor láser, que calienta el tubo capilar que está manipulando. Luego, el capilar se estrecha a medida que se alarga, hasta que finalmente se rompe en dos partes separadas. Aunque el cuarzo permite un control ligeramente mejor sobre el proceso de formación del tubo capilar, es hidrófobo, lo que genera complicaciones a la hora de llenar la nanopipeta con la solución acuosa necesaria para el flujo de iones. Por ello, los investigadores desarrollaron un protocolo que les permitió extraer nanopipetas de capilares de vidrio de borosilicato con el control y reproducibilidad necesarios.
Takahashi y sus colaboradores descubrieron que lo ideal es que el capilar de salida tenga paredes gruesas y un diámetro interior estrecho, pero no es fácil obtener tubos capilares que cumplan con estos requisitos de proveedores comerciales. En cambio, precalientan el capilar durante 5 segundos sin tirar de él, lo que hace que las paredes de vidrio se espesen y el diámetro interior disminuya. También optimizaron los parámetros para tirar del tubo, como la velocidad.
Los investigadores demostraron el rendimiento de las nanopipetas que fabricaron al obtener imágenes de una célula que sufre un tipo de endocitosis, en la que envuelve y absorbe material externo. Pudieron obtener imágenes de las microvellosidades (protuberancias de la membrana celular) en la superficie celular, la fosa endocítica en formación y la formación de una tapa que sella la fosa. Los intentos anteriores de limitación de imágenes se han visto obstaculizados por limitaciones de resolución espacial.
Los investigadores incluso lograron resolver vesículas extracelulares liberadas con un tamaño de sólo 189 nm. Como señalan en su informe, cada vez hay más pruebas de que estas vesículas extracelulares desempeñan un papel importante en la comunicación y la homeostasis entre células, y las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas se centran especialmente en las vesículas extracelulares más pequeñas, entre 40 nm y 150 nm. Los investigadores concluyen en su informe: «Anticipamos que este protocolo ayudará a fabricar de forma reproducible nanopipetas de borosilicato para mapeo topográfico de alta resolución utilizando SICM».
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