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Investigadores de la Universidad de Kanazawa informan en Química analítica Cómo fabricar nanopipetas que proporcionen de manera confiable imágenes de microscopía de conductividad iónica de barrido de células vivas con una resolución nanométrica.
Una visión a nanoescala de las células vivas puede proporcionar información valiosa sobre la estructura y función de las células. A lo largo de los años, se han utilizado diversas técnicas de microscopía para obtener información sobre muestras biológicas a nanoescala, pero todas han tenido sus limitaciones y desafíos. Aunque la microscopía de conductividad iónica de barrido (SICM) ha demostrado la capacidad de obtener imágenes de muestras biológicas vivas en solución a una resolución a nanoescala, se ha visto obstaculizada por desafíos en la fabricación confiable de nanopipetas con la geometría óptima para la tarea. Ahora, investigadores dirigidos por Yasufumi Takahashi en Nano LSI en la Universidad de Kanazawa y la Universidad de Nagoya han desarrollado un protocolo para producir nanopipetas de forma reproducible con la geometría preferida para obtener imágenes de alta calidad. La microscopía de conductividad iónica de barrido (SICM) utiliza una nanopipeta para controlar la distancia entre la nanopipeta y las muestras utilizando una corriente iónica como señal de retroalimentación. La forma de la nanopipeta influye significativamente en el rendimiento del dispositivo. Por ejemplo, una gran apertura limita la posible resolución, una derivación larga puede provocar efectos de rectificación que distorsionan las mediciones de la corriente iónica y, si el vidrio de la nanopipeta es demasiado grueso, puede deformar la muestra antes de que la apertura se acerque al punto requerido para la resolución topográfica. Se necesita mapeo con corriente iónica constante. Por lo tanto, la nanopipeta ideal tiene una derivación corta, una abertura pequeña y paredes de vidrio delgadas.
El procedimiento estándar para fabricar la nanopipeta es extraer un tubo capilar utilizando un extractor láser, que calienta el tubo capilar que se manipula. Luego, el capilar se estrecha donde se hace más largo hasta que finalmente se divide en dos partes separadas. Aunque el cuarzo permite un control ligeramente mejor sobre el proceso de formación del tubo capilar, es hidrófobo, lo que crea complicaciones a la hora de llenar la nanopipeta con la solución acuosa necesaria para el flujo iónico. Por ello, los investigadores desarrollaron un protocolo que les permitió tomar muestras de nanopipetas de capilares de vidrio de borosilicato con el control y la reproducibilidad necesarios.
Takahashi y sus colegas descubrieron que lo ideal es que el capilar de salida tenga paredes gruesas y un diámetro interior estrecho, pero no es fácil obtener tubos capilares que cumplan estos requisitos de proveedores comerciales. En cambio, precalientan el capilar durante 5 segundos sin tirar de él, lo que hace que las paredes de vidrio se espesen y el diámetro interior disminuya. También optimizaron los parámetros para tirar de la tubería, como la velocidad.
Los investigadores demostraron el poder de las nanopipetas que crearon al obtener imágenes de una célula que sufre un tipo de endocitosis en la que envuelve y absorbe material externo. Pudieron obtener imágenes de las microvellosidades (proyecciones de la membrana celular) en la superficie celular, los hoyos endocíticos que se forman y la formación de una tapa que cierra el hoyo. Los intentos anteriores de obtener imágenes de la formación de la capa se han visto obstaculizados por limitaciones en la resolución espacial.
Los investigadores incluso lograron disolver vesículas extracelulares liberadas con un tamaño de tan solo 189 nm. Como destacan en su informe, cada vez hay más pruebas de que estas vesículas extracelulares desempeñan un papel importante en la comunicación y la homeostasis entre células, y las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas se centran especialmente en las vesículas extracelulares más pequeñas de entre 40 nm y 150 nm. Los investigadores concluyen en su informe: «Anticipamos que este protocolo ayudará a fabricar de forma reproducible nanopipetas de borosilicato para mapeo topográfico de alta resolución utilizando SICM».
Fuente: https://www.kanazawa-u.ac.jp/e/
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