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Los científicos han desarrollado un método de cristalización de proteínas intracelulares para comprender la relación entre la estructura y la función de los cristales de proteínas. El uso de la cristalización de proteínas en la célula en biología estructural ha contribuido en gran medida a los avances en este campo y ha obviado la necesidad de pasos de cristalización y purificación de proteínas.
![Potente herramienta recomendada para cristalizar proteínas inestables](https://d1otjdv2bf0507.cloudfront.net/images/news/ImageForNews_39771_16651386741684495.jpg)
Estudio: cristalización de proteínas sin células para la determinación de la estructura de nanocristales. Crédito: ibreakstock/Shutterstock.com
Los cristales de proteínas se forman de forma no intencionada en las células vivas y no tienen el tamaño o la calidad suficientes para los estudios estructurales, lo que hace que el enfoque de cristalización de proteínas en la célula se limite a unas pocas proteínas. Un artículo publicado en Scientific Reports presentó una técnica libre de células para la cristalización directa de proteínas sin necesidad de una célula viva.
Aquí, el cristal de poliedro a nanoescala (PhC) se preparó mediante la síntesis de proteínas libres de células y su estructura se determinó mediante la técnica de difracción de rayos X (XRD) con una alta resolución de 1,80 angstroms. Además, se generaron nanocristales mediante el método de diálisis a una escala de reacción de 20 microlitros, seguido de un análisis de su estructura a una resolución de 1,95 angstroms.
Además, el análisis estructural de la proteína A de inclusión cristalina (CipA), un cristal bacteriano dentro de la célula, mediante la cristalización de proteínas libres de células ayudó a validar el potencial de la técnica. Se agregaron reactivos químicos a la solución de cristalización de proteínas libres de células como inhibidores gemelos, lo que permitió la determinación de la estructura de CipA con una resolución de 2,11 angstroms.
Síntesis de proteínas en células versus sin células
Recientemente, ha habido numerosos informes sobre la cristalización de proteínas en células vivas. Dichos cristales facilitan las funciones biológicas, incluida la catálisis heterogénea, el almacenamiento de proteínas y la activación del sistema inmunitario.
Desde el descubrimiento de la estructura poliédrica en 2007, la relación entre las estructuras y funciones de los cristales se ha estudiado mediante un análisis estructural preciso de cristales de tamaño micrométrico generados en células vivas.
La cristalización de proteínas en la célula omite los procedimientos de purificación y la detección exhaustiva de cristalización a gran escala para producir cristales de alta calidad. Por lo tanto, se espera que esta técnica de cristalización sea la herramienta de próxima generación en biología estructural.
Se han desarrollado varias técnicas de cristalización de proteínas intracelulares, incluida la optimización del cultivo celular y la detección de alto rendimiento, para abordar los problemas en el análisis estructural de proteínas. En este contexto, LaBaer et al. microcristales fabricados con éxito mediante la construcción de una serie de vectores de expresión de baculovirus para la producción de proteínas a gran escala en células de insectos. Las células de insectos y mamíferos que se utilizan actualmente para la cristalización de proteínas dentro de las células siguen representando un obstáculo significativo para la producción de grandes cantidades de microcristales de alta calidad.
En este sentido, un sistema de síntesis de proteínas sin células es una herramienta sencilla, rápida y sensible sin barreras unidas a la membrana, pero que contiene todos los sustratos y biomoléculas obligatorios necesarios para sintetizar las proteínas deseadas.
La síntesis de proteínas libres de células tiene el potencial de romper lagunas en la corriente en vivo sistemas de producción y es una herramienta prometedora tanto en la investigación científica básica como aplicada. Sin embargo, la síntesis de proteínas libres de células se ha considerado insuficiente para procesos de biología estructural como la cristalización, ya que requiere grandes cantidades de proteína.
Cristalización de proteínas en células versus libres de células de PhC y CipA
Informes anteriores han mencionado que las estructuras complejas de las células vivas afectan la cristalización de proteínas de PhC y CipA en la célula. Además, la cristalización de CipA mediante el método de cristalización de proteínas en la célula dio como resultado cristales maclados, lo que complicó la determinación de su estructura cristalina.
En este sentido, la cristalización de proteínas sin células facilitó la formación de cristales de proteínas a partir de un pequeño volumen de reacción de 20 microlitros. Por lo tanto, la cristalización de proteínas sin células permitió la formación de PhC 6 horas después del inicio de la reacción y se analizó a una resolución de 2,50 angstroms usando XRD.
Por el contrario, la cristalización de proteínas en la célula tardó tres días en obtener PhC sintetizados (PhC_IC) en células de insectos después de la infección por el virus, ya que las células de insectos se someten a diferentes procesos celulares para producir la proteína objetivo. Esta variación sugiere que la cristalización de proteínas sin células puede resolver el problema de la cristalización de proteínas de bajo rendimiento y alta calidad asociada con la cristalización de proteínas en las células.
La estructura cristalina de CipA se obtuvo a alta resolución utilizando XRD mediante la adición de un reactivo químico (1,4-dioxano) para inhibir el hermanamiento en la mezcla de reacción de cristalización de proteínas sin células. Los cristales de CipA obtenidos por cristalización de proteínas sin células (CipAC_CF) formaron una estructura multicapa con tetrámeros como bloques de construcción.
Conclusión
En resumen, se ha establecido un método de síntesis de proteínas libre de células para analizar cristales de proteínas en volúmenes de microlitros y en poco tiempo sin necesidad de procesos de purificación y cristalización.
La determinación de la estructura de los nanocristales dio como resultado estructuras de alta resolución de las proteínas. A pesar de la expectativa de los investigadores de que la cristalización de proteínas en las células podría ser una herramienta crucial en el análisis de estructuras de nanocristales, la dificultad para lograr una calidad y cantidad adecuadas de cristales limitó su uso.
Como alternativa, la síntesis de proteínas libres de células establecida en este estudio permitió la detección rápida de las condiciones de reacción y los efectos de los aditivos en las reacciones, y ayudó en la realización de cristales de proteína de alta calidad para la determinación de la estructura de nanocristales.
Los resultados de la investigación indicaron que la síntesis de proteínas libres de células podría ser una herramienta poderosa para determinar la estructura de nanocristales de proteínas inestables o de bajo rendimiento que son difíciles de cristalizar utilizando métodos convencionales de cristalización de proteínas en la célula.
Relación
Abe, S. et al. (2022). Cristalización de proteínas libres de células para determinar la estructura de los nanocristales. Informes científicos. https://www.nature.com/articles/s41598-022-19681-9#Abs1
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