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Las nanopartículas de oro (AuNP) se utilizan ampliamente en el diagnóstico biomédico debido a sus características únicas, que incluyen alta estabilidad coloidal, excelente absorción y dispersión de la luz visible, alta relación área superficial/volumen y facilidad de funcionalización.
Estudio: nanosondas de oro mejoradas para detectar polimorfismos de un solo nucleótido. La influencia del tamaño. Fuente de la imagen: Christoph Burgstedt/Shutterstock.com
un nuevo Caracterización de partículas y sistemas de partículas El estudio comparó las propiedades de los AuNP esféricos de 20 nanómetros y 35 nanómetros funcionalizados con un oligonucleótido modificado con tiol específico para desarrollar una nanosonda de Au mejorada para detectar el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) para la intolerancia a la lactosa.
La asociación entre SNP y la intolerancia a la lactosa
Los SNP están asociados con varias enfermedades y su detección es extremadamente importante pero desafiante. Esto se debe principalmente a que la detección de SNP requiere protocolos costosos y de alta sensibilidad.
La hipolactasia de tipo adulto, o intolerancia a la lactosa, es una condición en la que una persona no puede digerir cantidades significativas de lactosa. Esta incapacidad es genética y es común en las poblaciones europeas.
La intolerancia a la lactosa se ha asociado con 13910C/T (SNP) ubicado en el gen MCM6 y encontrado aproximadamente 14 kb antes del gen de la lactasa (LCT). El gen LCT está relacionado con la producción de la enzima lactasa, que descompone la lactosa. La mutación del gen MCM6 afecta la función de LCT.
Se observó que los individuos que contenían ambas copias del alelo T (C/T o T/T) en MCM6 podían digerir la lactosa. Por el contrario, aquellos sin una copia del alelo T (C/C) no podían digerir la lactosa.
Detección de SNP con nanosondas de Au
Los AuNP se consideran candidatos prometedores para nuevos ensayos colorimétricos para estudiar muestras biológicas como ácidos nucleicos y proteínas debido a sus coeficientes de extinción más altos para la banda de plasmón, que promueve la generación de colores intensos.
Las AuNP funcionalizadas con ADN tiolado monocatenario sirvieron como nanosondas excepcionales para la detección colorimétrica de secuencias específicas de ADN. Este método se basó en un enfoque de no reticulación. En 1991, una nanosonda desarrollada por el equipo de investigación pionero de CA Mirkin usó dos sondas de ADN tiolado monocatenario diferentes. Debido a problemas de estabilidad, se ha obstaculizado un mayor desarrollo de esta nanosonda.
El ADN se puede detectar fácilmente con nanosondas de oro en función del cambio de color visible. Este cambio de color ocurre con la adición de sal, que convierte las nanosondas de oro de un estado disperso a un estado agregado. Sin embargo, en el caso de los SNP, la sonda mutante se hibridó parcialmente con los oligos de la sonda, protegiendo la agregación inducida por la sal. Este evento produjo una diferencia insignificante en las propiedades ópticas entre las muestras positivas y mutantes, lo que imposibilitó la detección visual.
Se han desarrollado varios métodos para optimizar el rendimiento de ensayos similares basados en AuNP. Por ejemplo, se ha recomendado el uso de un espaciador entre el nucleótido y el grupo tiol porque puede evitar el impedimento estérico en la hibridación del objetivo. Aunque este enfoque mejoró la carga de ADN, redujo la interacción entre las bases de ADN y Au.
Nanosondas de Au mejoradas para detectar SNP en la intolerancia a la lactosa
Se planteó la hipótesis de que cambiar las propiedades ópticas y de agregación de los AuNP podría mejorar la detección de los SNP. Estas propiedades son muy sensibles al tamaño y la forma de las AuNP. Los AuNP más grandes mostraron una mejor sensibilidad de detección debido a sus coeficientes de extinción más altos. Además, las curvaturas más bajas de AuNP mejoraron la interacción con el objetivo.
Aquí, se desarrolló una nueva nanosonda de Au para la detección de SNP basada en un estudio comparativo de AuNP de 20 nanómetros y 35 nanómetros. Ambas nanosondas se funcionalizaron con oligonucleótido de 20 unidades modificado con tiol que era totalmente complementario a la secuencia de ADN de intolerancia a la lactosa (13910*C SNP) y moderadamente complementario a la secuencia de ADN de tolerancia a la lactosa (13910*T SNP).
El envejecimiento de la sal (SA) y los métodos de pH se utilizaron para funcionalizar AuNP de 20 y 35 nanómetros con diferentes concentraciones molares del oligonucleótido de 20 unidades modificado con tiol. Se prefirió el método de pH ya que dio como resultado la producción de nanosondas estables en proporciones bajas de oligonucleótidos: AuNP. Sobre la base de varios análisis, se determinó que la proporción funcionalizada óptima de nanosondas de Au de 20 y 35 nanómetros era 150 y 1300, respectivamente.
Después de la hibridación de las nanosondas de Au con las dianas de ADN y el control, se determinó su resistencia a la agregación inducida por sal mediante espectroscopia UV/Vis. Después de la hibridación con ADN totalmente complementario (CC), las muestras positivas no mostraron ningún cambio de color visible ya que las nanosondas de Au se volvieron resistentes a la agregación inducida por la sal. Sin embargo, tras la adición de sal al control, se observó un claro cambio de color de rojo a azul debido a la formación de agregados de nanosonda de oro.
Los límites de discriminación (LoD) para la detección de SNP utilizando nanosondas de Au de 35 nanómetros y 20 nanómetros mostraron límites de detección similares utilizando 0,15 nmol dm−3 concentración de nanosonda. Sin embargo, este no fue el caso a 2,5 nmol·dm−3 concentración de nanosonda.
Los resultados generales mostraron que la discriminación fue más eficiente para los objetivos de ssDNA de 40 mer que para los objetivos de ssDNA de 120 mer más grandes. Curiosamente, las nanosondas de Au de 35 nanómetros permitieron una reducción del 80 % de oro y del 48 % de oligonucleótidos utilizados en el ensayo. En comparación con las nanosondas de Au de 20 nm, las nanosondas de Au de 35 nm mostraron una mayor diferencia entre el ADN complementario y el no coincidente, que era independiente de la longitud del objetivo. Por lo tanto, se recomendó esta nanosonda para el desarrollo de futuros ensayos de detección de bajo costo.
Relación
Enea, M. et al. (2022) Nanosondas de oro mejoradas para detectar polimorfismos de un solo nucleótido. La influencia del tamaño. Caracterización de partículas y sistemas de partículas. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ppsc.202200137
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