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(Noticias de Nanowerk) Una nueva variante del sistema de edición de genes CRISPR-Cas9 facilita el rediseño de grandes cantidades de células para aplicaciones terapéuticas. Desarrollado en los Institutos Gladstone y UC San Francisco (UCSF), el enfoque permite a los científicos entregar secuencias de ADN extralargas a ubicaciones precisas en el genoma de las células con una eficiencia notablemente alta, sin los sistemas de entrega viral tradicionalmente utilizados para transportar el ADN en el transporte. células.
«Durante muchos años, uno de nuestros objetivos ha sido colocar largas instrucciones de ADN en una ubicación específica del genoma de una manera que no dependa de los vectores virales», dice Alex Marson, MD, PhD, director de Gladstone-UCSF. Instituto de Inmunología Genómica y autor principal del nuevo estudio. «Este es un gran paso hacia la próxima generación de terapias celulares seguras y efectivas».
En el nuevo artículo publicado en la revista biotecnología natural («Ingeniería genómica de alto rendimiento en células primarias usando una plantilla de reparación de ssDNA híbrida y cócteles de moléculas pequeñas») Marson y sus colegas no solo describen la tecnología, sino que muestran cómo se puede usar para generar células CAR-T con el potencial de hacerlo puede usarse para combatir el mieloma múltiple, un cáncer de la sangre, y para reescribir secuencias de genes en las que las mutaciones pueden conducir a enfermedades inmunitarias hereditarias raras.
«Hemos demostrado que podemos generar más de mil millones de células en una sola ejecución, lo que supera con creces la cantidad de células que necesitamos para tratar a un solo paciente», dice el autor principal Brian Shy, MD, PhD, asociado clínico. en el laboratorio de Marson.
Del ADN bicatenario al ADN monocatenario
CRISPR-Cas9, un sistema que edita genes en células vivas, se ha utilizado como herramienta de investigación básica durante la última década. Muchos científicos clínicos están cada vez más entusiasmados con el potencial de CRISPR-Cas9 para desarrollar terapias con células vivas.
Entre otras cosas, la edición de genes se puede usar para apagar, eliminar o reemplazar un gen mutado que causa una enfermedad o para aumentar la actividad de lucha contra el cáncer de una célula inmunitaria. Si bien las primeras aplicaciones terapéuticas de CRISPR-Cas9 ingresaron recientemente a ensayos clínicos, la tecnología aún estaba limitada por el desafío de producir de manera segura grandes cantidades de células diseñadas correctamente.
Tradicionalmente, los investigadores se han basado en vectores virales, las envolturas de los virus sin sus componentes causantes de enfermedades, para entregar el ADN utilizado para la terapia génica (llamado plantilla de ADN) en las células. Sin embargo, la producción de grandes cantidades de vectores virales de grado clínico ha sido un obstáculo importante para llevar las terapias celulares a los pacientes. Además, los investigadores no pueden controlar fácilmente dónde insertan genes los vectores virales tradicionales en el genoma.
«El uso de vectores virales es costoso y requiere muchos recursos», dice Shy. «Una gran ventaja de un enfoque no viral de la ingeniería genética es que no estamos tan limitados por los costos, la complejidad de la fabricación y los desafíos de la cadena de suministro».
En 2015, el grupo de Marson, en colaboración con el laboratorio de la pionera de CRISPR, Jennifer Doudna, PhD, demostró por primera vez que podían insertar plantillas cortas de ADN en células inmunitarias sin vectores virales mediante el uso de un campo eléctrico que atraviesa las membranas externas del hizo las células más permeables. Para 2018, desarrollaron un método para usar CRISPR para cortar e insertar secuencias de ADN más largas en las células inmunitarias.
Luego, en 2019, los investigadores descubrieron que podían entregar las nuevas secuencias al genoma objetivo utilizando también una versión modificada de las plantillas de ADN que pueden unirse a la enzima Cas9, la misma proteína producida durante CRISPR. La edición de genes actúa como un sitio de tijeras moleculares de manera más eficiente. .
Sin embargo, se necesitaba más trabajo para mejorar el rendimiento de las células inmunitarias diseñadas con éxito y hacer que el proceso fuera compatible con la fabricación de futuras terapias celulares. Estos objetivos motivaron el estudio actual del equipo.
El ADN puede estar en hebras simples o dobles (como velcro opuesto), y Cas9 se une al ADN de doble hebra. Los investigadores descubrieron rápidamente que grandes cantidades de plantilla de ADN de doble cadena pueden ser tóxicas para las células, por lo que el método solo podía usarse con pequeñas cantidades de plantilla de ADN, lo que resultaba en una baja eficiencia.
El equipo sabía que el ADN monocatenario es menos tóxico para las células, incluso en concentraciones relativamente altas. Entonces, en el nuevo artículo, describen un método para unir la enzima Cas9 modificada a una plantilla de ADN monocatenario agregando solo un pequeño saliente de ADN bicatenario en los extremos.
«Esto nos brinda un enfoque equilibrado que ofrece lo mejor de ambos mundos», dice Marson.
La plantilla de ADN de cadena sencilla podría más que duplicar la eficiencia de la edición de genes en comparación con el enfoque anterior de cadena doble. Y los extremos de doble cadena de las moléculas permiten a los investigadores usar Cas9 para mejorar la entrega de vectores no virales a las células.
«Esta tecnología tiene el potencial de hacer que las nuevas terapias celulares y génicas sean más rápidas, mejores y más económicas», dice Jonathan Esensten, MD, PhD, autor del nuevo artículo, profesor asistente de medicina de laboratorio en la UCSF e investigador asociado. en Gladstone.
Un camino a la clínica
En el estudio, los investigadores utilizaron la nueva plantilla de ADN para generar más de mil millones de células CAR-T que se dirigen al mieloma múltiple. Las células CAR-T son células T del sistema inmunitario que han sido modificadas genéticamente para combatir eficazmente células o cánceres específicos. Con las nuevas plantillas monocatenarias impulsadas por Cas9, aproximadamente la mitad de todas las células T recibieron el nuevo gen y, por lo tanto, se convirtieron en células CAR T.
«Sabíamos que dirigir las plantillas de ADN a un sitio específico del genoma, llamado sitio TRAC, mejoraría la potencia antitumoral de las células CAR-T», dice Justin Eyquem, PhD, coautor del nuevo comunicado. Profesor Asistente de Medicina en el Departamento de Hematología y Oncología de la UCSF e Investigador Asociado en Gladstone. «Este nuevo enfoque no viral nos permite lograr este objetivo de manera mucho más eficiente, lo que acelerará el desarrollo de terapias de células CAR-T de próxima generación».
Además, los investigadores demostraron que su enfoque puede, por primera vez, reemplazar por completo dos genes asociados con enfermedades inmunitarias genéticas raras, los genes IL2RA y CTLA4.
En el pasado, los científicos habían demostrado que pueden reemplazar pequeñas secciones del gen IL2RA cuando ciertos pacientes tienen mutaciones. Ahora, el equipo de Marson ha demostrado que pueden reemplazar todos los genes IL2RA y CTLA4 a la vez: un enfoque de «talla única» que podría tratar a muchos pacientes con diferentes mutaciones en estos genes, en lugar de plantillas personalizadas para aquellos que tienen que crear una mutación para cada uno. paciente. Casi el 90 por ciento de las células tratadas con este enfoque de ingeniería genética recibieron las versiones sanas de los genes.
Los investigadores ahora buscan la aprobación para avanzar en los ensayos clínicos utilizando la tecnología CRISPR no viral tanto en la terapia con células CAR-T como en el tratamiento de la deficiencia de IL2RA.
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