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La leptospirosis es una enfermedad bacteriana que afecta tanto a humanos como a animales. Esta enfermedad zoonótica es más frecuente en los países tropicales. En una reciente Nanomateriales aplicados ACS En un estudio, los investigadores demostraron la creación de un sensor inmunitario que puede detectar de forma rápida y precisa Leptospira en muestras clínicas.
Estudio: sensor electroquímico desechable basado en nanopartículas de oro para la detección de leptospirosis en muestras clínicas. Crédito: Jarun Ontakrai/Shutterstock.com
Este inmunosensor de un solo uso se desarrolló utilizando electrodos de papel modificado (PPE) con nanopartículas de oro (AuNp) junto con nanotubos de carbono (CNT) marcados con anti-LipL32 monoclonal (e-LipL32).
¿Qué sabemos sobre la leptospirosis?
Entre las zoonosis, la leptospirosis es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, con aproximadamente 1,03 millones de casos notificados cada año. Esta enfermedad es común en poblaciones con recursos limitados, particularmente en países de bajos a medianos ingresos. El impacto global de la leptospirosis no se comprende bien, ya que es una de las enfermedades que se ha descuidado en todo el mundo.
La leptospirosis es causada por espiroquetas patógenas del género Leptospira. Es extremadamente difícil distinguir entre especies de espiroquetas patógenas y especies no patógenas sobre la base de características morfológicas y bioquímicas.
Algunos factores comunes que conducen a la propagación mundial de la leptospirosis son el cambio climático, la globalización y una variedad de huéspedes mamíferos. La leptospirosis a menudo se diagnostica erróneamente debido a múltiples síntomas no específicos. Por lo tanto, existe la necesidad de un método de diagnóstico más preciso para ayudar en la detección temprana para que el tratamiento adecuado pueda comenzar de inmediato.
Los métodos de diagnóstico disponibles para la leptospirosis carecen de precisión, sensibilidad, portabilidad y repetibilidad. Para el diagnóstico clínico de la enfermedad, prueba de aglutinación macroscópica (MAT), reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR), prueba de cultivo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas IgM (ELISA), análisis de fusión de alta resolución (HRM) y PCR en tiempo real ( RT-PCR) se utilizan principalmente.
Entre estos métodos, MAT se considera el estándar de oro para el diagnóstico de leptospirosis. No obstante, este método lleva mucho tiempo, requiere instrumentos raros, mantenimiento de múltiples cultivos vivos, personal calificado y está limitado a ciertos laboratorios. Para la detección temprana y el tratamiento de la leptospirosis, es fundamental el desarrollo de un nuevo sistema de detección sensible, económico, rápido y fácil de usar.
Sensor inmunológico electroquímico basado en nano para el diagnóstico de leptospirosis
Recientemente, se desarrolló un sensor electroquímico altamente sensible, selectivo y desechable basado en nanopartículas de oro para detectar leptospirosis en muestras de suero. Para la producción de e-LipL32 en PPE modificados con AuNp unidireccionales, se aplicó un inmunoensayo electroquímico tipo sándwich combinando LipL32, anti-LipL32 y anti-LipL32 (CNT-Ab) con etiqueta de nanotubos de carbono.
AuNp resultó en un aumento significativo en la tasa de transferencia de electrones y también ayudó en la inmovilización de moléculas específicas para el sensor inmunológico fabricado. Se usó glutatión (GSH) para promover la formación de una monocapa autoensamblada (SAM) intrincadamente ordenada en el AuNp a través del enlace covalente S-Au. Los SAM de GSH permitieron la adición de una cantidad apropiada de ácido carboxílico (grupo funcional) así como la inmovilización de AntiLipL32 monoclonal. La actividad biológica de las proteínas inmovilizadas fue preservada por SAM.
La presencia de la etiqueta CNT facilitó un mejor reconocimiento inmunológico, que actuó como un potenciador de la señal al aumentar la tasa de transferencia de electrones. Por lo tanto, el etiquetado de CNT mejoró la selectividad y la sensibilidad del inmunosensor eLipL32.
Se utilizaron técnicas de análisis como el análisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) y microscopía electrónica de barrido (SEM) para validar la fabricación exitosa del sensor e-LipL32. Los estudios morfológicos superficiales confirmaron la inmovilización de GSH y mAb en PPE-Au.
Se optimizaron la concentración de GSH y el tiempo requerido para formar GSH SAM en la superficie del electrodo basado en AuNp. Se eligió GSH 10 mM como la concentración óptima ya que exhibió un potencial redox máximo debido a la interacción electrostática del grupo carboxilo de GSH con la sonda catiónica. Dado que la mejor respuesta de corriente de oxidación se obtuvo a 10−6 g/ml de anticuerpo, esta se eligió como la concentración de anticuerpo óptima para la producción del nuevo sensor e-LipL32.
Es importante destacar que el sensor desechable e-LipL32 demostró una mayor sensibilidad a LipL32, con un límite de detección máximo estimado en 1 μg/mL y un límite de detección inferior en 348 fg/mL. Además, este inmunosensor electroquímico mostró excelente selectividad, reproducibilidad y aceptable estabilidad a largo plazo.
Validación clínica del inmunosensor
Para la validación clínica del sensor e-LipL32, se utilizaron 20 muestras de suero de personas sospechosas de tener leptospirosis y otras enfermedades febriles. Las muestras clínicas de pacientes con enfermedad febril mostraron un pequeño aumento en la corriente, mientras que las muestras de leptospirosis mostraron una intensificación significativa de la corriente máxima en casi tres veces. Este hallazgo indica la alta especificidad del inmunosensor e-LipL32 hacia la proteína LipL32 presente en las muestras clínicas. El sensor inmunológico basado en AuNp recientemente desarrollado pudo detectar LipL32 en muestras clínicas en 60 minutos.
Para confirmar aún más la eficiencia de detección del sensor e-LipL32, los resultados de las muestras clínicas analizadas se compararon con el estándar de oro MAT, la prueba puntual de IgM y el ELISA de IgM. Además, para distinguir el diagnóstico positivo de leptospirosis de otras enfermedades, se calculó un diagrama de caja basado en las corrientes máximas promediadas de todas las muestras clínicas. Una corriente superior a 9,8 μA se determinó como el umbral para un diagnóstico positivo de leptospirosis, que fue confirmado por la prueba MAT.
En conclusión, el sensor e-Lip32 se puede utilizar para detectar con precisión la leptospirosis en su etapa inicial de infección tanto en condiciones limitadas como ricas en recursos.
Relación
Kannan, S. et al. (2022) Sensor electroquímico desechable basado en nanopartículas de oro para la detección de leptospirosis en muestras clínicas. Nanomateriales aplicados ACS. https://doi.org/10.1021/acsanm.2c0197
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