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(Noticias de Nanowerk) Un laboratorio de la Universidad de Rice está liderando los esfuerzos para descubrir amenazas potenciales a la eficacia y seguridad de las terapias basadas en CRISPR-Cas9, la técnica de edición de genes ganadora del Premio Nobel, incluso si parece estar funcionando según lo diseñado.
El bioingeniero Gang Bao de la Escuela de Ingeniería George R. Brown de Rice y su equipo señalan esto en un artículo publicado en avances científicos («Análisis integral y cuantificación precisa de grandes modificaciones genéticas involuntarias inducidas por la edición de genes CRISPR-Cas9») que, aunque las ediciones fuera del objetivo en el ADN han sido durante mucho tiempo una preocupación, los cambios ocultos asociados con el procesamiento en el objetivo también deben reconocerse, y cuantificado.
Bao señaló un 2018 biotecnología natural Paper («La reparación de roturas de doble cadena inducidas por CRISPR-Cas9 da como resultado grandes deleciones y reordenamientos complejos») sugirió la presencia de grandes deleciones. “Fue entonces cuando comenzamos a investigar qué podemos hacer para cuantificarlos, gracias a los sistemas CRISPR-Cas9 desarrollados para tratar la enfermedad de células falciformes”, dijo.
![Desde la izquierda: Julie Park, Lavanya Saxena, Mingming Cao y Gang Bao](https://www.nanowerk.com/news2/biotech/id61698_1.jpg)
Bao ha sido un firme defensor de CRISPR-Cas9 como una herramienta para tratar la enfermedad de células falciformes, una búsqueda que lo ha llevado a él y a sus colegas cada vez más cerca de una cura (Ciencia Medicina Traslacional, «Desarrollo de la corrección del gen de la globina β en células madre hematopoyéticas humanas como posible tratamiento permanente para la enfermedad de células falciformes»). Ahora, los investigadores temen que grandes deleciones u otros cambios de edición de genes no detectados puedan persistir en las células madre a medida que se dividen y diferencian y, por lo tanto, tienen implicaciones para la salud a largo plazo.
«No tenemos una buena comprensión de por qué se pueden perder unos pocos miles de bases de ADN en el sitio de escisión de Cas9 y las roturas de doble cadena de ADN aún se pueden volver a unir de manera eficiente», dijo Bao. “Esa es la primera pregunta y tenemos algunas hipótesis. La segunda es ¿cuáles son las consecuencias biológicas? Las deleciones grandes (LD) pueden llegar a los genes vecinos y alterar la expresión tanto del gen objetivo como de los genes cercanos. No está claro si los LD podrían dar como resultado la expresión de proteínas truncadas.
«También podría tener proteínas que se pliegan incorrectamente o proteínas con un dominio adicional debido a las inserciones grandes», dijo. «Podrían pasar todo tipo de cosas, y las células podrían morir o tener funciones anormales».
Su laboratorio desarrolló un método que utiliza la secuenciación de una sola molécula en tiempo real (SMRT) con identificadores moleculares únicos duales (UMI) para encontrar LD no deseados junto con grandes inserciones y reordenamientos cromosómicos locales asociados con pequeñas inserciones/deleciones (INDEL) y para cuantificar un Cas9 interfaz en el objetivo.
«Para cuantificar grandes cambios genéticos, necesitamos hacer PCR de largo alcance, pero eso podría introducir artefactos durante la amplificación del ADN», dijo Bao. «Así que usamos UMI de 18 bases como una especie de código de barras».
«Los agregamos a las moléculas de ADN que queremos amplificar para identificar moléculas de ADN específicas para reducir o eliminar los artefactos debido a la PCR de largo alcance», dijo. «También desarrollamos una tubería de bioinformática para analizar datos de secuenciación SMRT y cuantificar los LD y las inserciones grandes».
La herramienta de Bao lab llamada LongAmp-seq (para secuenciar amplicones largos) cuantifica con precisión tanto los INDEL pequeños como los LD grandes. A diferencia de SMRT-seq, que requiere el uso de un secuenciador de lectura larga que a menudo solo está disponible en una instalación central, LongAmp-seq se puede realizar usando un secuenciador de lectura corta.
Para probar la estrategia, el equipo de laboratorio, dirigido por la estudiante graduada de Rice Julie Park, ahora profesora asistente de bioingeniería, usó Streptococcus pyogenes Cas9 para probar la beta-globina (HBB), la gamma-globina (HBG) y el linfoma de células B. potenciador de leucemia 11A (BCL11A) en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) de pacientes con enfermedad de células falciformes y el gen PD-1 en células T primarias.
Descubrieron que se produjeron grandes deleciones de hasta varios miles de bases con alta frecuencia en las HSPC: hasta el 35,4 % en HBB, el 14,3 % en HBG y el 15,2 % en los genes BCL11A y en el gen PD -1 (15,2 %) en las células T.
Dado que dos de los ARN guía CRISPR específicos probados por el laboratorio de Bao se utilizan en ensayos clínicos para tratar la enfermedad de células falciformes, es importante determinar las consecuencias biológicas de los grandes cambios genéticos debido a las roturas de doble cadena inducidas por Cas9.
Bao dijo que el equipo de Rice actualmente está analizando las consecuencias de las eliminaciones largas en el ARN mensajero, el mediador que codifica para que los ribosomas produzcan proteínas. «Luego pasamos al nivel de proteínas», dijo Bao. «Queremos saber si estas grandes deleciones e inserciones persisten después de que las HSPC editadas genéticamente se hayan trasplantado a ratones y pacientes».
Los coautores del estudio de Rice son los estudiantes de posgrado Mingming Cao y Yilei Fu, los ex alumnos Yidan Pan y Timothy Davis, el especialista en investigación Lavanya Saxena, el microscopista/especialista en bioinstrumentación Harshavardhan Deshmukh y Todd Treangen, profesor asistente de informática, y Vivien de la Universidad de Emory Sheehan, profesor asociado de pediatría.
Bao es jefe de departamento y profesor de bioingeniería de la familia Foyt, profesor de química, ciencia de los materiales y nanoingeniería e ingeniería mecánica, y miembro del CPRIT en investigación del cáncer.
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