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(Noticias de Nanowerk) Los investigadores han desarrollado un enfoque de espectroscopia Raman no invasivo y sin etiquetas que puede tomar imágenes microscópicas de muestras biológicas e identificar una amplia gama de biomoléculas con una velocidad y sensibilidad sin precedentes.
«Nuestro trabajo podría conducir a un dispositivo no invasivo, sin etiquetas y fácil de usar para uso clínico», dijo el líder del equipo de investigación, Dario Polli, del Politecnico di Milano en Italia. «Este innovador microscopio, junto con algoritmos basados en el aprendizaje profundo, en última instancia podría hacer que el diagnóstico del cáncer sea más fácil y rápido al permitir la visualización de los componentes químicos de los tejidos y las células humanas».
en el diario Óptica Express («Fingerprint multiplex CARS at high speed based on supercontinuum generation in bulk media and deep learning spectral denoising»), los investigadores describen su nueva técnica, que se basa en la microscopía coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS). La microscopía CARS genera imágenes basadas en las firmas vibratorias de las moléculas al explotar la interacción entre los pulsos láser ultracortos y las muestras biológicas.
El nuevo enfoque brinda acceso a la esquiva región del espectro vibratorio conocida como la región de la huella dactilar, que se extiende desde 400 a 1800 cm−1. Aunque muchos compuestos individuales pueden identificarse por sus huellas dactilares vibratorias en esta región, tiende a producir señales débiles que son difíciles de detectar.
«Las técnicas de uso común en las ciencias biomédicas a menudo requieren tinción, lo que no solo es engorroso, sino que también puede introducir cambios estructurales y químicos que pueden generar artefactos o errores en las imágenes y el procesamiento de datos», dijo Polli. «Debido a que nuestro sistema puede discriminar entre muchas especies químicas diferentes en tejidos biológicos sin etiquetado, podría ser útil para obtener imágenes de células vivas y analizar biopsias de tejido».
Tasa de repetición más baja, imágenes más rápidas
Este nuevo trabajo forma parte del proyecto CRIMSON, financiado por la Comisión Europea, cuyo objetivo es desarrollar un dispositivo de imagen llave en mano que utilice espectroscopia vibratoria para la clasificación rápida de células y tejidos. El objetivo del proyecto es transformar la investigación sobre el origen celular de las enfermedades para permitir nuevos enfoques que puedan avanzar en las terapias personalizadas.
Como paso crucial hacia este objetivo, los investigadores desarrollaron un microscopio CARS basado en un láser comercial que genera pulsos ultracortos con una duración de aproximadamente 270 femtosegundos en el rango de longitud de onda del infrarrojo cercano. Diseñaron el sistema de microscopía para usar pulsos láser con una frecuencia de repetición de 2 MHz, que es mucho más baja que los 40 u 80 MHz utilizados por la mayoría de los otros sistemas CARS.
Esta tasa de repetición más baja reduce el daño fototérmico a la muestra porque crea un retraso de 0,5 microsegundos entre dos pulsos consecutivos. También produce una energía de pulso más alta y una intensidad máxima en el punto focal, produciendo una señal CARS más fuerte y permitiendo una velocidad de adquisición más rápida.
«El beneficio más importante de la tasa de repetición más baja es que pudimos generar pulsos de Stokes de banda ancha con corrimiento al rojo que cubren todo el rango de vibración de la huella digital utilizando la generación supercontinua de luz blanca en un cristal a granel», dijo Federico Vernuccio, estudiante de doctorado en el Politécnico. di Milano y primer autor del estudio. «En comparación con otros métodos, este enfoque es técnicamente más simple, más compacto y más robusto».
El uso de un rango espectral desplazado hacia el rojo en comparación con las configuraciones estándar significa que se pueden usar intensidades de láser más altas antes de que ocurra el fotodaño. Los investigadores también desarrollaron nuevos algoritmos que combinan enfoques computacionales numéricos estándar con inteligencia artificial. Estos algoritmos extraen información adicional de los datos recopilados y la convierten en imágenes que permiten distinguir fácilmente diferentes especies químicas.
«Gracias a nuestras mejoras, el sistema CARS ofrece imágenes de alta calidad a una velocidad de adquisición de última generación», dijo Vernuccio. “Nuestro sistema tiene un tiempo de permanencia de píxeles de menos de 1 milisegundo sin comprometer la integridad de la muestra. Esta velocidad está limitada por la tasa de actualización del espectrómetro”.
sensibilidad de alta velocidad
Para probar su sistema, los investigadores utilizaron muestras de referencia para comparar los espectros obtenidos con el nuevo microscopio con los adquiridos utilizando una técnica de espectroscopia vibratoria de última generación, aunque más lenta. Los dos métodos mostraron una excelente concordancia, lo que demuestra que el nuevo sistema puede generar espectros a muy altas velocidades con buena resolución espectral y especificidad química.
Luego, los investigadores determinaron el límite de detección de su sistema mediante el registro de espectros CARS de una serie de soluciones de dimetilsulfóxido en diferentes concentraciones. El sistema pudo medir la concentración química con una sensibilidad sin precedentes de 14,1 mmol/litro, que es aproximadamente el doble de la sensibilidad de otros sistemas CARS que trabajan en el dominio de las huellas dactilares.
También demostraron la capacidad del sistema para distinguir y localizar espacialmente diferentes perlas de plástico transparentes del tamaño de un micrómetro en función de su firma vibratoria, y tomaron medidas en tejidos biológicos para demostrar que la técnica funciona en muestras biológicas sin causar daños.
«Nuestro microscopio CARS permite imágenes sin etiquetas con especificidad química a velocidades más altas, lo que hace que las imágenes Raman de células vivas sean más factibles», dijo Polli. «Por lo tanto, nuestro sistema podría usarse, por ejemplo, para analizar las interacciones de las células cancerosas con las células inmunitarias o para caracterizar cómo la quimioterapia afecta a las células».
Los investigadores ahora están trabajando para mejorar su sistema generando un rango de longitud de onda aún más amplio de pulsos de Stokes a través de la generación de supercontinuo de luz blanca. Esto mejoraría tanto la velocidad de formación de imágenes como el número de analitos químicos detectables. También están trabajando hacia la comercialización mediante el desarrollo de software fácil de usar, fuentes ópticas compactas y diseños para un prototipo comercial y un sistema de detección.
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